2023年4月9日，安徽医科大学/南京医科大学孙倍成团队在Journal of Hepatology（If=30）在线发表了题为“A TNFα/Miz1-positive feedback loop inhibits mitophagy in hepatocytes and propagates nonalcoholic steatohepatitis”的研究论文，该研究发现在人类NASH中，Miz1的含量在肝细胞中减少。Miz1被证明与过氧化物还蛋白6 (PRDX6)结合，在细胞质中能阻止PRDX6在Cys431位点与线粒体Parkin相互作用，促进Parkin介导的线粒体自噬。该研究结果表明，在NASH肝脏中肝细胞Miz1的缺失会导致PRDX6抑制线粒体自噬，肝细胞中功能失调的线粒体增加，以及肝巨噬细胞产生促炎细胞因子，包括TNFα。

一、研究背景

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一种慢性炎症性疾病，可进一步发展为肝硬化和肝细胞癌。然而，这一过程背后的关键分子机制尚不清楚。安徽医科大学第一附属医院孙倍成团队通过RNA测序和液相色谱-质谱分析了人类NASH和正常肝组织样本，确定肝细胞胞浆蛋白Miz1是NASH进展的潜在靶点。作者用肝细胞特异性Miz1基因敲除和过表达小鼠建立了NASH模型。通过人NASH肝脏类器官证实其机制，免疫沉淀和质谱法用来检测可能与Miz1相互作用的蛋白。

二、主要结果

1. 脂肪肝中Miz1蛋白降解与NAFLD的严重程度相关

为了说明Miz1在人类NASH中的临床意义，作者用质谱法检测了Miz1在人类NASH (n = 5)和正常组织(n = 5)中的表达，结果显示Miz1在NASH中显著降低。单纯脂肪变性患者肝脏中的Miz1蛋白水平低于非脂肪变性对照组，而在NASH组中更低(图1A-C)。此外，肝脏中Miz1蛋白水平与NASH特征呈负相关，活动评分、体重指数和生化标准都证明了这一点(图1D)。此外，在WDF（添加15%果糖的西式饮食）和MCDD（缺乏蛋氨酸和胆碱饮食）诱导的NASH小鼠模型中也证实了人类Miz1数据的直接相关性(图1E)。

2.肝细胞特异性Miz1缺乏可促进NASH的发展

为了研究Miz1在NASH中的作用，作者构建了肝细胞特异性Miz1全长缺失和Miz1(POZ)敲除小鼠(以下简称ΔHep或POZΔHep)。五组小鼠(野生型[WT]、POZF/F、POZΔHep、F/F和ΔHep)分别饲喂WDF或MCDD诱导NASH(图2A)。所有小鼠NASH模型均显示肝细胞空泡化、脂肪变性和纤维化，其他四组之间无显著差异。血清生化水平、循环丙氨酸转氨酶/天冬氨酸转氨酶和NASH标志物也与这些发现一致(图2B, D)。Miz1缺失引起的变化在肝细胞特异性Miz1(POZ)敲除小鼠中不存在，表明它们不是由于Miz1的转录调节。采用注射AAV8-Miz1或Miz1(ΔPOZ)的WT小鼠建立NASH模型。结果表明，肝细胞中Miz1的过表达可以独立于POZ结构域减少NASH的发展(图2E-H)。总的来说，研究结果证明在人类NASH肝脏中看到的较低的Miz1不是偶然的相关性，Miz1的缺失是NASH发展的原因，这与它的转录活性无关。

3. Miz1缺乏导致线粒体自噬的抑制和受损线粒体的积累

通过透射电镜(TEM)检查了小鼠肝组织中的线粒体。Miz1缺失导致线粒体肿胀积聚，嵴结构异常(图3A)。从F/F和ΔHep小鼠中提取原代肝细胞(以下简称F/F和ΔHep原代肝细胞)，并用游离脂肪酸(FFAs)刺激以模拟体内代谢应激的影响。免疫荧光显示Miz1可以影响线粒体积累，而耗氧比和细胞外酸化率分析显示Miz1不参与调节线粒体功能。这些结果表明，Miz1可能与线粒体清除有关，而不是与线粒体代谢的变化有关。

作者通过对线粒体蛋白进行免疫印迹分析，结果表明Miz1缺失导致线粒体蛋白积累，包括泛素结合支架蛋白p62。与其他三组相比，ΔHep组自噬标志物LC3-II/I比值降低(图3B)。然后分离F/F和ΔHep原代肝细胞，用原载体羰基氰化间氯苯基肼(CCCP)处理，诱导线粒体自噬。这些体外实验证实了体内研究结果(图3C)。此外，Miz1缺乏会产生过多的线粒体ROS，表明受损线粒体的积累(图3D)。此外，免疫荧光显示ΔHep的线粒体自噬通量明显低于F/F原代肝细胞(图3E)。通过抗Tomm20免疫荧光显微镜发现ΔHep原代肝细胞线粒体清除率不足(图3F)。这些数据表明Miz1缺乏导致线粒体自噬的抑制和受损线粒体的积累。

4. Miz1与PRDX6的相互作用阻断了PRDX6线粒体定位，增强了线粒体泛素化

线粒体蛋白的泛素化是其与自噬体膜结合的关键步骤，免疫印迹显示，Miz1缺失减少了独立于POZ结构域的线粒体蛋白的泛素化(图4A, B)。为了证实Miz1如何调节线粒体泛素水平，作者通过免疫沉淀和质谱法稳定表达His-Miz1，确定了HepG2细胞中可能与Miz1相互作用的蛋白(图4C)，并将PRDX6作为一个有趣的靶点(图4D)。在F/F、ΔHep和POZΔHep原代肝细胞和过表达Miz1、Miz1(ΔPOZ)或PRDX6(以下简称HepG2-Miz1+、Miz1(ΔPOZ)+和PRDX6+)的HepG2细胞中通过共免疫沉淀证实了这种相互作用(图4E)。Miz1在肝细胞中独立于POZ结构域与PRDX6相互作用。

为了揭示Miz1、PRDX6与线粒体自噬之间的关系，作者在过表达Miz1和/或PRDX6的HepG2细胞以及感染慢病毒短发夹(sh)PRDX6的F/F和ΔHep原代肝细胞中建立了NASH模型。结果显示，Miz1过表达导致线粒体泛素增加，而PRDX6过表达在CCCP处理的肝细胞中阻断了这种作用(图4F)。免疫印迹显示，CCCP处理后的原代肝细胞和HepG2细胞中，PRDX6在MOM上的定位程度比未治疗时更大。此外，Miz1缺失导致PRDX6的线粒体定位增加，Miz1过表达导致PRDX6在细胞质中积累，PRDX6在MOM上没有定位，无论是否使用CCCP(图4G)。免疫荧光也证实了这些事件(图4H, I)。这些结果表明，Miz1作用于PRDX6的上游，与PRDX6相互作用，阻断PRDX6的线粒体定位，从而增强线粒体泛素化和线粒体自噬。

此外，在MCDD诱导的NASH模型中，AAV8-Miz1+、AAV8-PRDX6+和AAV8-双过表达Miz1+和PRDX6+的模型显示，Miz1过表达减少而PRDX6过表达促进NASH进展。PRDX6过表达阻断Miz1诱导的NASH预防(图4J)。TEM显示Miz1过表达增强了线粒体清除率，而PRDX6过表达可以阻断这种作用(图4J)。

5. Miz1降解导致PRDX6解离并易位到Parkin Cys431，在NASH阶段抑制Parkin自身泛素化和Parkin介导的有丝分裂，而在NAFLD阶段则没有。

WDF诱导NASH模型的免疫沉淀显示，Parkin在8周时与PRDX6相互作用，然后增加，而MG132阻断了这种作用(图5A)。共免疫沉淀显示Miz1、PRDX6和Parkin不能形成三蛋白复合物(图5B)。接下来，作者研究了Parkin在PRDX6线粒体定位中的作用。免疫印迹显示，Parkin缺失完全阻断了PRDX6的线粒体定位(图5C)。在线粒体自噬过程中，Parkin通常是一种依赖于Cys431和Arg280的泛素酶，共免疫沉淀显示PRDX6在Cys431位点与Parkin相互作用，而在Arg280位点不相互作用。

由于Parkin-Cys431在激活Parkin泛素酶活性中起作用，作者研究了PRDX6与Parkin-Cys431相互作用的功能。Parkin Cys431突变抑制了Miz1过表达诱导的线粒体泛素化。Parkin Cys431突变和PRDX6过表达显著抑制线粒体泛素化。同时，PRDX6的敲低恢复了Miz1缺失导致的线粒体泛素减少，而Cys431的突变阻断了PRDX6的这种功能(图5D)。此外，AAV8-Miz1+/shPRDX6/Parkin+/Parkin-Cys431+被用于MCDD诱导的NASH模型。Miz1过表达和PRDX6敲低显著抑制NASH进展，而Parkin-Cys431突变完全阻断这些作用并增强NASH(图5E)。此外，透射电镜显示，Miz1过表达和PRDX6敲低增强了线粒体自噬，而Parkin-Cys431突变阻断了这种作用(图5E)。这些结果表明，Miz1在NASH期间被泛素化降解。导致PRDX6被募集到Parkin-Cys431，阻断Parkin自泛素化，从而抑制Parkin介导的有丝分裂。

最近的一项研究表明，PRDX6通过抑制Notch对NAFLD具有保护作用，这一结论与本文的研究相反。因此，作者认为PRDX6可能在NAFLD-NASH的不同阶段和不同刺激条件下具有双重功能。首先，对还原性谷胱甘肽/氧化性谷胱甘肽比值的分析表明，在饲喂WDF之前，PRDX6具有抗氧化作用。此外，免疫印迹显示，在饲喂WDF 8周后的24小时FFA刺激中，PRDX6可以开始与Parkin相互作用。同时，PRDX6在该时间点之前动态升高，然后下降(图5F-H)。这些结果表明，PRDX6在NAFLD阶段具有有益的抗氧化作用，但在NASH阶段具有负性的线粒体自噬抑制作用。

6. 肝细胞中Miz1蛋白的减少通过PRDX6诱导的Parkin介导的线粒体自噬抑制，导致NLRP3/IL-1β和NLRP3/TNFα轴的激活增加

接下来，作者在NASH小鼠模型中研究了Miz1对炎症因子和炎症小体mRNA水平的影响。RT-qPCR结果显示，Miz1缺失导致炎性因子和炎性小体成分mRNA表达增加。此外，在Miz1缺失组以及F/F和ΔHep原代肝细胞中，IL-1β、TNFα及其上游炎性体NLRP3的mRNA表达显著升高(图6A)。然后，为了确认Miz1是否通过增加线粒体自噬来调节NLRP3/IL-1β和NLRP3/TNF-α信号轴，作者用抑制线粒体自噬的药物阻断了线粒体自噬。免疫印迹证实了F/F和ΔHep原代肝细胞对线粒体自噬的依赖抑制，并表明Miz1缺失导致Caspase-1和NLRP3的激活增加，而抑制线粒体自噬使这些作用恶化(图6B)。然后，作者在体内用liensinine23和Brefeldin A24阻断线粒体自噬或用MCC95025阻断NLRP3的激活(图6C, D)。结果表明，抑制线粒体自噬可阻断Miz1过表达诱导的NASH及IL-1β和TNFα分泌抑制。此外，抑制NLRP3激活显著阻断Miz1缺陷诱导的NASH加重和IL-1β和TNFα分泌(图6E, F)。ELISA在体外证实了Miz1、线粒体自噬、NLRP3、IL-1β和TNFα分泌之间的关系(图6G)。

7. TNFα-诱导的肝细胞Miz1蛋白减少可通过PRDX6/Parkin轴抑制线粒体自噬

作者对正常和NASH组织的RNA测序数据进行KEGG分析显示，NASH进展过程中TNF信号通路高度富集(图7A)，提示NASH肝脏中肝细胞Miz1蛋白的减少可能是由肝脏炎症微环境自然引起的。从WT小鼠中提取的原代肝细胞分别用TNFα、IL-1β或IL-6处理，免疫印迹显示只有TNFα诱导Miz1降解，而MG132阻断Miz1降解。这些结果表明，Miz1可以通过E3泛素化被TNFα特异性降解。

为了确定Miz1降解是否也会在NASH中引起类似的分子变化，用TNFα刺激WT原代肝细胞来模拟自然NASH条件下的炎症环境。共免疫沉淀显示，TNFα刺激减少了与PRDX6相互作用的Miz1的数量(图7B)。当TNFα诱导Miz1降解时，定位于MOM的PRDX6数量增加，而用MG-132抑制TNFα诱导的Miz1降解可阻断这一作用。此外，WT原代肝细胞的共免疫沉淀显示，随着TNFα刺激，Parkin与PRDX6相互作用的数量增加，而MG132介导的Miz1降解抑制阻止了这种作用(图7C)。

免疫印迹法显示，TNFα抑制CCCP诱导的WT原代肝细胞有丝分裂(图7D)。同时，利用可抑制TNFα功能的英夫利昔单抗处理WDF诱导的NASH。结果显示，抑制TNFα可维持线粒体自噬，抑制炎症小体/炎症因子轴，从而限制NASH进展(图7E, F)。共聚焦免疫荧光检测人类样本中的Miz1和TNFα，发现Miz1与人类样本中NASH和TNFα水平呈负相关(图7G, H)。这些结果表明脂肪肝中Miz1蛋白水平与NAFLD的严重程度和TNFα水平呈负相关。

8.肝细胞中Miz1的降低通过类器官PRDX6/Parkin轴限制线粒体自噬，从而加重NASH进展

为了证实人类NASH的这些分子机制，作者提取并构建了肝类器官，并检测了这些关键点。结果显示，Miz1在NASH组中减少，导致线粒体自噬和NLRP3减少，而过表达Miz1逆转了这些变化(图8A, B)。同时，免疫印迹证实了类器官中Miz1、线粒体自噬和NLRP3之间的关系。共免疫沉淀揭示了Miz1, PRDX6和Parkin在类器官中的相关性(图8C, D)。这些结果表明这些分子机制存在于人肝脏组织中。

三、总结

总结一下这篇文章的主要发现：

1. NASH患者肝细胞Miz1水平较低。

2. Miz1结合PRDX6并阻断其抑制有丝分裂的能力。

3. 肝细胞Miz1的减少降低了线粒体自噬，增强了肝细胞和巨噬细胞TNFα的产生。

4. TNFα通过E3泛素化进一步降低Miz1，导致线粒体自噬进一步降低。

原文链接：A TNFα/Miz1-positive feedback loop inhibits mitophagy in hepatocytes and propagates non-alcoholic steatohepatitis - Journal of Hepatology (journal-of-hepatology.eu)